1979. február 16-án az észak-olaszországi Urbino városában született, a világbajnoki harmadik helyezett motorversenyző Graziano Rossi fiaként. Tízévesen már egy 100 köbcentiméteres gokarttal versenyzett (anyja féltette, nem engedte kismotorra ülni), és junior regionális bajnokságot nyert. A következő évtől már minimotorokon versenyzett, és több győzelmet aratott.
Apja segítségével 1993-ban debütálhatott a 125 köbcentis kategóriában. Jóllehet első motorját azonnal összetörte, a következő évad utolsó futamán megszerezte élete első pole pozícióját, majd 1995-ben a Cagiva gyári csapatának színeiben megnyerte az olasz bajnokságot.
Nemzetközi pályafutása 1996-ban, az Aprilia gyári csapatában indult. A szezonban egy futamgyőzelmet aratott, kilencedik lett, majd 1997-ben már megszerezte első világbajnoki címét, 11 győzelme és 321 pontja akkoriban rekordnak számított.
Az 1998-as szezont már a 250 köbcentis géposztályban kezdte, és a második helyen végzett, alig három ponttal lemaradva az olasz Loris Capirossitól. 1999-ben aztán ebben a kategóriában is megszerezte a világbajnoki címet, viszonylag nagy fölénnyel, 48 pontos előnnyel végzett az élen.
2000-ben a Honda csapatával mutatkozott be a királykategóriában, amely akkor az 500 köbcentiméteres motorokat jelentette. Első évében két győzelmet aratott és második lett, majd 2001-ben kilenc versenyt megnyerve a 16-ból ismét világbajnok lett. A versenysorozat neve a következő évtől lett MotoGP, a motorok lökettérfogata a korábbi 500-ról csaknem a duplájára, 990 köbcentiméterre nőtt, és átálltak a kettőről a négy ütemre is. A váltás a „Doktornak”, ahogy Rossit becézik, nem okozott gondot, 11 győzelmet aratva szerezte meg újabb világbajnoki címét, egy kieséstől eltekintve minden versenyen az első vagy második helyen végzett, majd 2003-ban ismét világbajnok lett.
2004-ben, a Hondával történt viharos szerződésbontás után – jelentős kockázatot vállalva – a gyengébb motorokat kínáló Yamaha csapatánál folytatta. Ezekkel a gépekkel is vetélytársai fölé tudott nőni, s első versenyzőként szerzett két egymást követő szezonban két különböző csapat színeiben világbajnoki címet. 2005-ben sorozatban ötödik világbajnoki címét gyűjtötte be, ezekben az években egyeduralkodó volt, sorra döntötte meg a különböző rekordokat. A következő időszakban bukások, technikai gondok hátráltatták, 2006-ban második, 2007-ben harmadik lett. 2008-ban visszaült a trónra, ismét pontrekorddal lett világbajnok, és a Francia Nagydíjon megszerezte 90. győzelmét, utolérve az örökranglistán előtte álló Ángel Nietót. Két év kihagyás után sikerült ismét világbajnoki címet szereznie, erre rajta kívül csak Giacomo Agostini volt képes, majd 2009-ben begyűjtötte kilencedik világbajnoki címét is.
Első komolyabb balesete 2010-ben történt, az olasz versenyen a bokáját és a sípcsontját is eltörte. Pályafutása során először hagyott ki versenyt, előtte megszakítás nélkül 230 viadalon állt rajthoz, ami ugyancsak rekord. Negyvenegy nappal és négy versennyel később már ismét a motoron ült, a szezon végén harmadik lett összetettben. 2011-től 2012-ig a Ducati csapatában versenyzett, 2011-ben hetedik, 2012-ben hatodik lett.
2013-ban visszatért a Yamaha csapatához. 2014-ben Mugellóban háromszázadik nagydíján állt rajthoz, amit egy harmadik hellyel tett emlékezetesebbé. Ugyanabban az évben Misanóban ismét ő állhatott a dobogó legfelső fokára, győzelmének köszönhetően átlépte az ötezer pontos álomhatárt, sem előtte, sem azóta nem szerzett senki ennyi világbajnoki pontot. A szezont végül másodikként fejezte be, ezt megismételte 2015-ben és 2016-ban is. 2017-ben ötödik, 2018-ban harmadik lett a vb-összetettben. 2018-ban további két évre, 2020-ig szóló szerződést kötött a Yamahával, s Colin Edwards 2014-es visszavonulása óta az első 40 év feletti versenyző lett a MotoGP-ben.
A Doktor néven is ismert Rossi versenyzői zsenialitása megkérdőjelezhetetlen: kilenc vb-t nyert (egyet a 125, egyet a 250 köbcentis, hetet a királykategóriában), ezzel az örökranglistán a harmadik a 15 címet begyűjtő Giacomo Agostini és a 13 címet elérő Ángel Nieto mögött, de az egyetlen, aki négy kategóriában is világbajnok lett. Összesen 382 versenyen indult, ezek közül 232-n a dobogón végzett és 115-öt megnyert, első és eddigi utolsó győzelme között több mint 20 év telt el, és ő az egyetlen GP-versenyző, aki 14 egymást követő éven át minden szezonban legalább egy versenyt nyert.
Az évek során számtalan nagy ellenfele akadt, ezek közül talán az ugyancsak olasz Max Biaggival vívta a leglátványosabb csatákat a pályán és a bokszutcában is, ezt egy 2003-as dokumentumfilm meg is örökítette. Többször is tesztelt különféle versenyautókat, raliautóval több versenyen is részt vett. A Forma-1-gyel is kacérkodott, ki is próbálta a Ferrarit, de több teszt után végül mégis maradt a MotoGP-ben.
Bravúros motorozásával, egyéni stílusával és a győzelmek utáni látványos ünnepléseivel népes rajongótábort szerzett magának, ennek hollétét a futamokon élénksárga szín jelzi a lelátón. A ruhája hátán is a Doktor nevet viselő Rossi mindig a 46-os rajtszámmal versenyez, egyfajta örökségként, mert az apjának is ez volt a rajtszáma. Az egyik legismertebb olasz az Inter focicsapatának lelkes szurkolója. Szülővárosa úgy tisztelgett előtte, hogy 50-ről 46 km/órára csökkentette a településen érvényes sebességhatárt, az ottani egyetemtől tiszteletbeli diplomát kapott.
